1. Maken van een biologische opname

Opnames worden best met een zekere stapgrootte in de x-, de y- en de z-richting worden gesampled om het beeld optimaal te kunnen reconstrueren. Deze stapgrootte is afhankelijk van de emissiegolflengte waarbij men opneemt. Bijvoorbeeld in het geval van FITC (excitatie 480 nm, emissie 520 nm) moet de stapgrootte in de x-richting en in de y-richting 47 nm zijn (0.047 micrometer). De afstand tussen de verschillende coupes moet 165 nm (0.165 micrometer) bedragen.

Andere emissiegolflengten kunnen hieruit gemakkelijk worden berekend met de regel van drie (voor een twee keer zo grote golflengte mogen alle stappen twee keer groter). Let wel op: deze stappen zijn zeer klein, en geven doorgaans aanleiding tot enorm grote files. De te restaureren opnamen zijn echter niet zo gevoelig voor dit criterium.

Emissiegolflengte	stapgrootte x,y	stapgrootte z
260 nm	23 nm	82 nm
520 nm	47 nm	165 nm
1050 nm	94 nm	330 nm

2. Beadopname

Het is noodzakelijk om in dezelfde sessie waarin men de biologische opnames maakt, ook enkele beadopnames te maken. Best is dat de beads gekleurd zijn met een fluorochroom met ongeveer gelijke excitatie- en emissiegolflengte als die van het biologisch preparaat. De op te nemen beads hebben best een diameter van 200 nanometer (0.2 micrometer). Voor de biologische opnames speelde de grootte van de stappen in x, y en z niet zo'n grote rol, maar bij beadopnames moet hier zel strict aan worden gehouden. Verder is het ook aangewezen om een veld op te nemen waarin meerdere beads te zien zijn. Deze beads geven dan een beeld hoe de optiek elk punt precies uitsmeert tot een vlekje, de zogenaamde Point Spread Function (PSF). Deze kennis is noodzakelijk om later het biologisch beeld te corrigeren, en de resolutie te verbeteren. Men kan echter niet betrouwen op eerder genomen beadopnames, want de PSF is enorm afhankelijk is van allerlei factoren, zoals temperatuur, aflijning van de spiegels,...

3. Signaal/ruis

Over het algemeen bevatten opnames die in "direct" worden opgenomen een zekere hoeveelheid ruis. Deze kan worden uitgemiddeld door hetzelfde beeld meerdere malen op te nemen, en dan deze beelden uit te middelen door ipv van "direct" te kiezen voor "accumulate", en dan voor zowel "N" als "factor" minimum 5 te kiezen (liefst dezelfde waarde). Ruis is namelijk in elke scanning anders, en door uit te middelen blijft het object zelf over, maar ruis middelt uit. Dus elke coupe N keer opnemen, en elke opname voor 1/N laten meetellen.

4. Beelden versturen

Zet deze beelden op biochem4 met een ftp-programma. Let wel dat de transfer gebeurt in binary mode!!

5. De reconstructie zelf

Open de verstuurde beelden met het Huygens programma. Kies bij Huygens het menu "File" en in dit menu "open". Het geselecteerde beeldje verschijnt in het klein in het Huygens venster.

Open het beadbeeldje dat in dezelfde sessie werd opgenomen als de biologische opname (liefst met meer dan één in de opnameen met coupes ver genoeg boven en onder de beads gesampled tot zeker geen signaal meer in het beeld zichtbaar is). Pas op deze opname "avgspheres" toe. Deze operatie wordt gestart door naast de thumnail van het betreffende beeldje op de button "o" te klikken (opent het operation window).

Klik dan in het pas geopende window op de button "avgspheres". Dan verschijnt in de lege rechthoek rechts het volgende:

Daar wordt gevraagd een aantal parameters in te geven, zoals de STRAAL van de beads (meestal wordt commercieel de diameter opgegeven). Klik voor de rest maar alle vlaggetjes aan, en stuur de output naar een leeg vakje (liefst niet het vakje "psf", want dat heb je later nog nodig).

Om nu de PSF te reconstrueren zijn er twee mogelijkheden. De eenvoudigste is om gewoon de knop "R PSF" te gebruiken.

Hier moet je gewoon de plaats invoeren waar hij de te berekenen PSF uiteindelijk gaat zetten (kies hiervoor psf). Verder vraagt hij weer de straal van de beads, en de geschatte signal/noise ratio. Zie hiervoor Huygens handleiding pagina 58-59 voor meer uitleg, maar 40 is doorgaans aanvaardbaar voor 10 keer uitgemiddelde beadopnames. blijf van de rest af en klik op "run". Effe geduld, en daar is uw PSF...

Minder ideaal, maar ook bruikbaar is een theoretische PSF te genereren. Hiermee wordt bedoeld de PSF die een ideaal afgelijnde microscoop met gegeven optische eigenschappen (zoals numerieke apertuur, ...) zou hebben.

Open nu een beeld dat je wil optimaliseren. Hiervoor zijn er verschillende methodes, waarvan QTM (Quick Tikhonov-Miller) de snelste is, maar de minst goede resultaten levert. Deze methode is in feite op te vatten als een soort preview van wat de krachtiger methoden zullen geven als resultaat...

Een ander voorbeeld is MLE (Maximum Likelihood Estimation). Deze methode is zeer goed, maar is ook zeer traag.

Verder is er nog ICTM, die daar tussenin ligt.

Je vult telkens alle parameters in, (voor "estimated background" kun je in het hoofdmenu "analysis" openen, en daar "estimate background" nemen ("lowest value" kiezen bij "search for background". Deel dat door twee en vul dat in (dit is een vuistregeltje, want de waarde die hij geeft is toch meestal te groot). Let wel op voor zwarte randen bij kopiëren van een beeld naar een ander beeld dat grotere dimensies had. In dat geval zal de laagst gevonden waarde in de achtergrond natuurlijk nul zijn, en geen aanpassing uitvoeren.